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[溃疡性结肠炎]P选择素和ICAM-1对小鼠溃疡性结肠炎的研究

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更多 发布于:2012-09-06 00:31
陈维雄,陈金联,达炜,陈尼维,朱金水,上海市第六人民医院消化内科 上海市 200233
项目负责人  陈维雄, 200233,上海市第六人民医院消化内科
电话:021-64369181
收稿日期  2002-03-05  接受日期  2002-03-18


摘要
目的:探讨P选择素单克隆抗体(单抗)对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及其治疗机制.

方法:在小鼠溃疡性结肠炎模型上观察了黏附分子P选择素和ICAM-1的变化,并用P 选择素单抗对其进行阻断治疗.

结果:溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜充血、水肿,糜烂或溃疡(以直肠和远端结肠明显),上皮细胞坏死、脱落,黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)及隐窝脓肿形成;P选择素单抗处理鼠未见明显病理变化,疾病活动指数(DAI)和病理学评分明显改善.ELISA法测定发现,溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1水平显著升高,而经P选择素单抗处理的小鼠P选择素未见升高.

结论:P选择素和ICAM-1与溃疡性结肠炎密切相关,P选择素单抗对溃疡性结肠炎具有治疗作用.

陈维雄,陈金联,达炜,陈尼维,朱金水.P选择素和ICAM-1对小鼠溃疡性结肠炎的研究.世界华人消化杂志 2002;10(6):722-724


0  引言
近年我国溃疡性结肠炎的发病率逐渐增高.其发病机制迄今尚未明了.近年研究发现,白细胞在内皮细胞上的滚动是由选择素介导的,随后牢固的黏附则是由内皮上细胞间黏附分子-1(ICAM-1)与整合素相互作用完成1-3].本文在建立小鼠溃疡性结肠炎模型基础上,观察黏附分子P选择素和ICAM-1的变化及P选择素单抗的防治作用.

1  材料和方法
1.1  材料
健康♀BALB/c小鼠,7-9wk.重约20g,共45只(中国科学院上海实验动物中心).5%硫酸葡聚糖(DSS),购自sigma公司,M r5000.P选择素单抗,购自苏州医学院.血浆P选择素及血清ICAM-1检测试剂盒购自苏州医学院.
1.2  方法  小鼠随机分为试验组(n=30)与正常对照组(n=15). 试验组动物口服5%硫酸葡聚糖溶液7d,再随机分为单抗组与PBS组,单抗组(n=14)第1-5天内腹腔内注射P选择素单抗,剂量为2mg/kg体重(以100ulPBS液体稀释),PBS组(n=16)每只仅注射PBS液100ul. 正常对照组小鼠自由饮水. 所有动物均于第7天处死,分离大肠,沿肠系膜附着部剪开肠壁,置10%甲醛液中固定,分段取材.结肠炎症评价采用疾病活动指数(DAI)和病理学评分.DAI综合体重下降的百分率(体重不变为0,1-5为1分,5-10为2分,10-15为3分,大于15为4分)、大便黏稠度(正常为0,松散的大便为2分,腹泻为4分)和大便出血(正常0分,隐血阳性为2分,显性出血为4分)积分.病理学评分为HE切片10个高倍视野(100倍)的平均评分,其中以正常结肠黏膜为0级,隐窝缺损1/3时为1级,隐窝缺损2/3时为2级,固有层覆盖单层上皮伴轻度炎性细胞浸润为3级,黏膜糜烂、溃疡伴显著的炎细胞浸润者4级.血浆P选择素及血清ICAM-1采用ELISA法检测,静脉采血,分别置于含1/10体积2%EDTA.Na抗凝管及普通管中,3000转/min离心10min,收集上层,置-20℃下保存待测.
      统计学处理  结果以±s表示,数据统计采用t检验.

2  结果
2.1  疾病活动指数(DAI)  
小鼠在喂食DSS溶液后第3或第4天出现腹泻,隐血试验阳性,第5-6天出现程度不同的血便,体重明显减轻,DAI为2.375±0.156;但经P选择素单抗治疗的小鼠血便、腹泻明显减轻,体重未见明显下降,DAI平均为1.60±0.241,差异显著,P<0.01.
2.2  病理学评分 于喂食DSS液第7天处死动物,肉眼观察结肠炎严重度与体重下降、血便、腹泻程度相一致.结肠炎病变从肛门侧开始向上连续性发展,但逐渐减轻,以直肠、乙状结肠最为明显,而近端结肠基本正常.可见黏膜显著充血水肿,散在性糜烂或溃疡伴出血,此与人类溃疡性结肠炎相似.结肠组织HE染色,光镜下观察,越近肛门侧病理改变越明显,可见上皮细胞变化、坏死、脱落,杯状细胞减少,黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)、隐窝脓肿形成等.但小鼠经P选择素单抗注射治疗后,则结肠未见明显的炎性细胞浸润及充血水肿与糜烂、溃疡等,病理学评分较PBS处理的小鼠明显减低(表1).
2.3  P选择素和ICAM-1含量  循环血中P选择素和ICAM-1含量与小鼠溃疡性结肠炎程度有关.正常对照鼠P选择素和ICAM-1含量较低,小鼠有溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1含量则明显升高,经P选择素单抗治疗的小鼠P选择素和ICAM-1明显被抑制,后者与正常对照鼠无明显差别.各组血浆P选择素和血清ICAM-1的ELISA测定结果见表2.

表1  各组小鼠的病理学评分  (x±s)
组别n直肠
PBS组161.720±0.162
P选择素单抗组140.585±0.108b

bP<0.01 vs PBS组.

表2  各组动物血浆P选择素和血清ICAM-1含量  (x±s)
组别nP选择素含量(ng/ml) ICAM-1(ng/ml)
正常组150.097±0.016128±31.0
PBS组160.262±0.054b 361±47.4b
P选择素单抗组140.106±0.018132±29.1

bP<0.01 vs 正常组或单抗组.


3  讨论
近年黏附分子在炎性细胞的浸润、肠组织炎症形成中重要作用已逐渐被人们重视.选择素是最近被确定的一类黏附分子家族,其重要成员之一的P选择素(GMP140,MW140000)主要分布于中等大小血管内皮细胞棒状小体(Weibel-palade)以及血小板α颗粒,并随这些细胞活化而迅速出现在细胞膜表面或释放至血液中,其在炎症的早期反应中起着重要作用,而E选择素或细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在内皮细胞受刺激后数小时内表达.研究表明,黏附分子P选择素和ICAM-1通过介导中性粒细胞和单核细胞在内皮细胞上的滚动(Rolling)和黏附,在炎症的发生、发展中起着重要作用3-9].
      DSS近年被广泛用于实验性溃疡性结肠炎研究10].本文研究中给小鼠喂食DSS液后出现腹泻,体重下降和血便等,大肠从直肠开始自下而上肠黏膜连续性炎性病变,主要表现为明显充血、水肿、炎性细胞浸润、杯状细胞减少、隐窝脓肿、糜烂或溃疡形成等.该模型与人类溃疡性结肠炎接近,可为溃疡性结肠炎的实验研究提供理想的动物模型.
      本文发现小鼠喂食DSS 7d后结肠出现了显著的病理改变,但经P选择素单抗处理的小鼠结肠则未见明显的病理改变,其DAI和病理学积分改善显著.Seino et al[11]的研究结果表明ICAM-1单抗对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有防治作用.Hamamoto et al[12]发现ICAM-1单抗或E选择素单抗对实验性溃疡性结肠炎具有治疗作用.Bennett et al[13]用ICAM-1反义寡核苷酸皮下注射溃疡性结肠炎小鼠,可阻断结肠炎的发生、发展.结果表明P选择素单抗的抗黏附治疗对溃疡性结肠炎具有治疗作用.
      小鼠溃疡性结肠炎时循环血中P选择素和ICAM-1含量明显高于P选择素单抗治疗的溃疡性结肠炎小鼠,后者与正常对照鼠无明显差别(P>0.05),这与Nielsen et al[14,15]的研究结果一致.说明P选择素和ICAM-1升高与溃疡性结肠炎炎症相关,而P选择素单抗可能通过抑制中性粒细胞、单核细胞对内皮的黏附和由此引起的炎症反应,从而使上述黏附分子表达或释放减少.

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