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[溃疡性结肠炎]电针治疗溃疡性结肠炎模型大鼠的作用机制

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更多 发布于:2012-09-06 00:33
田力,黄裕新,闻勤生,李艳梅, 赵海峰,王庆莉,中国人民解放军第四军医大学唐都医院消化内科 陕西省西安市 710038
田力,女,1974-04-16生,山西省长治市人,汉族,1997年毕业于山西医科大学临床医学系,硕士生,住院医师,助教.
国家自然科学基金资助项目,No.39970888
项目负责人 黄裕新,中国人民解放军第四军医大学唐都医院消化内科,陕西省西安市新寺路710038. tianli72@263.net
电话:86-29-3377597,3377721
收稿日期 2002-01-28 接受日期 2002-04-08

摘要
目的
:观察电针足三里穴对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠的治疗作用, 并探讨电针该穴位对其致炎细胞因子: 肿瘤坏死因子-alpha( TNF-a)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)及髓过氧化物酶(MPO)的调节作用.进一步阐明UC的发病机制,并揭示电针足三里穴的治疗作用机制.
方法:32SD大鼠随机分为4组(n =8):正常对照组、UC模型对照组、UC模型+针穴组(双侧足三里穴)、UC模型+非穴组(双侧足三里穴旁0.5cm. 以三硝基苯磺酸·乙醇液灌肠诱导建立UC大鼠模型. 在大鼠清醒状态下, 针穴组、非穴组分别电针其双侧足三里穴、足三里穴旁0.5cm. 10 d后同时处死4组大鼠. 以结肠重量、组织损伤评分、结肠组织MPO活性、IL-6IL-8TNF-a等指标来评价其炎症和损伤程度.结肠组织损伤评分通过解剖显微镜观察得出.并用分光光度分析法测定结肠组织MPO活性,放射免疫分析法(RIA)检测大鼠血清中IL-6IL-8TNF-a含量.
结果:与正常对照组相比,UC模型对照组结肠质量/体质量 (mC/mB) (mg/g)MPO活性(μkat/g 组织)均显著增加(分别为8.53±2.59 vs 2.46±0.42; 145.2±25.3vs 24.3±7.8, P<0.01.血清TNF-aIL-6IL-8ng/L)水平也明显升高(分别为2278±170 vs 894±248; 170±36 vs 57±7;806±125 vs 153±42,P <0.01.电针足三里穴后,UC模型对照组相比, mC/mBMPO活性显著降低(分别为5.29±2.04 vs 8.53±2.59;103.5±35.7 vs 145.2±25.3,P <0.05);血清TNF-aIL-6IL-8含量也明显下降(分别为1913±232 vs 2278±170, p<0.01; 125±34 vs 170±36, P <0.05; 608±205 vs 806±125,P <0.05.UC模型对照组组织损伤评分也明显增加,电针足三里穴可使其下降.UC模型对照组相比,非经非穴刺激对上述各指标均无显著影响. mC/mB、组织损伤评分、结肠MPO活性、细胞因子IL-6IL-8TNF-a含量之间相互成正相关性(P ≤0.001.
结论:UC模型大鼠血清IL-6IL-8TNF-a含量及结肠组织MPO活性均显著升高,且两两密切相关,其水平与病情轻重程度及病变范围有关.提示: IL-6IL-8TNF-a可引起UC的炎症免疫反应,其含量升高可能参与UC的免疫发病机制.电针足三里穴对UC模型大鼠有良好的治疗作用,这种作用机制可能与电针足三里穴良性下调促炎细胞因子IL-6IL-8TNF-a有关.

田力,黄裕新,闻勤生,李艳梅,赵海峰,王庆莉.电针治疗溃疡性结肠炎模型大鼠的作用机制.世界华人消化杂志 2002;10(8):916-921

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引言
溃疡性结肠炎(UC)在我国发病率有上升的趋势,其发病机制还不明确,考虑为感染、遗传、环境、免疫等综合因素所致,免疫系统调节异常起了重要作用[1-4].在免疫系统的调节过程中,细胞因子起着关键作用.许多实验证实促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间失衡参与UC的发病机制[6,7].针刺足三里穴有良性免疫调节作用[8-11],影响许多细胞因子的生成和表达[12-17].临床上用针刺治疗UC取得良好的疗效,且副作用小[18,19]. 我们在建立UC大鼠模型基础上,观察结肠质量、组织损伤评分、髓过氧化物酶活性、血清促炎细胞因子的变化及他们之间的相互关系,进一步了解该细胞因子在UC发病中的作用;并采用电针刺激足三里穴,探索电针对这些因素的影响,从而揭示电针对UC的作用机制,为针刺治疗UC提供新的理论依据.
1 材料和方法
1.1
材料 健康成年二级SD大鼠32(由本校实验动物研究中心提供),体质量220±20g.三硝基苯磺酸(TNBS)5g/L溴化十六烷基三甲胺溶液、反应液(由本校药理实验室合成提供).放免试剂盒由北京北免东雅生物技术研究所制备.G6805-A电针仪由广东省汕头市医用设备厂生产.FG-2003-50Gr计数仪由西安国营二六二工厂生产.752型紫外可见分光光度计由上海第三分析仪器厂制造.
1.2
方法 所有大鼠均在安静环境下饲养,自由进食饮水,实验前24h禁食不禁水.将大鼠随机分为4(n =8):正常对照组,UC模型对照组,UC模型+针穴组(双侧足三里穴),UC模型+非穴组(足三里穴旁0.5cm). UC大鼠模型的复制:用30%乙醇液将TNBS配制成50g/L溶液.乙醚麻醉动物,将一直径2mm长约12cm的橡胶管由肛门轻缓插入深约8cm,100mg/kg剂量推入该溶液,然后捏紧肛门平放8min[5,20-24].正常对照组则推入生理盐水. 造模6h后开始治疗, UC模型大鼠于造模24h后出现腹泻、消瘦、少动、毛不光洁等表现.针穴组选取双侧足三里穴,即大鼠后肢腓骨小头下0.5cm[1115].电针参数为疏密波,频率2HZ,强度2V,以大鼠双下肢轻微抖动为宜.针刺时将大鼠固定于特制的有机玻璃笼内,在其清醒状态下,连续刺激足三里穴30min,1/d,连续10d.非穴组部位选取足三里穴旁0.5cm,其余处理与针穴组相同.正常组及模型对照组大鼠在每天同一时辰固定30min,但不行针刺.治疗结束后称大鼠体质量,随后断头取血置干燥管中,分离血清,-20冰箱保存待测细胞因子.取肛门以上大肠8cm,沿纵轴剪开,4生理盐水冲洗,滤纸吸干称重,将黏膜向上平铺于冰块上,用解剖显微镜观察组织损伤程度并进行评分[5,20,21,25].取部分病变结肠组织,切取1mm3组织用40g/L戊二醛固定作电镜检查,余组织用40g/L甲醛固定作病理切片,观察其病理变化;将剩余结肠组织保存于-70冰箱备测MPO活性. 采用分光光度分析法检测MPO活性[20,21]:将结肠组织剪碎,加入5g/L溴化十六烷基三甲胺溶液制成50g/L匀浆液,超声震荡(10s,3),将匀浆置于4超速离心机中离心15 min(15 000g/ min).取上清液0.1mL,加入2.9mL反应液,测定其在460nm30s90s内的吸光度值变化.1μkat MPO酶活力以25℃60s分解1μmolH2O2表示.(2)血清TNF-aIL-6IL-8含量按试剂盒要求应用RIA法检测.
  统计学处理 组织损伤评分为偏态分布,Kruskal-Wallis秩和检验分析;其余指标均用SPSS10.0软件进行统计分析,数据均以x±s表示,多组间比较用方差分析.
2 结果
2.1 电针对UC
大鼠形态学的影响 与正常组比较, UC模型对照组的组织损伤评分和mC/mB明显增高(P <0.01). 电针足三里穴后, ,损伤评分及mC/mB均较模型对照组显著降低(P <0.05). 而非穴组与模型对照组相比无显著性差异( P >0.05) (1,2).UC模型对照组病理结果显示:黏膜上皮细胞坏死脱落、溃疡形成、大量炎细胞浸润及充血水肿,炎性肉芽组织增生. UC模型对照组相比,针穴组病理表现有所减轻,其溃疡面积缩小、炎细胞浸润程度减轻,但非穴组病理变化不明显.正常组大鼠则无异常改变(1-4).电镜检查结果为:UC模型对照组及非穴组均表现微绒毛短粗稀少,线粒体明显水肿,内质网扩张;针穴组微绒毛较多且细长,杯状细胞较多,细胞器水肿不明显(5-8).
图1 正常对照组 结肠黏膜上皮完整,肠腺内有较多杯状细胞. HE×100
图2 UC模型对照组 结肠黏膜上皮大片坏死,形成大面积溃疡,有大量炎细胞浸润. HE×100
图3 UC模型+针穴组 结肠黏膜局部表浅小溃疡,炎细胞浸润程度轻. HE×100
图4 UC模型+非穴组 结肠黏膜上皮大片坏死,形成大面积溃疡,有大量炎细胞浸润. ×100
图5 正常对照组 结肠黏膜上皮细胞微绒毛多且排列整齐,肠腺内可见较多杯状细胞,胞质内富含黏液滴. TEM×4 000
图6 UC模型对照组 结肠黏膜上皮细胞微绒毛稀少,变短粗,线粒体明显肿胀,内质网扩张.TEM×6 000
图7 UC模型+针穴组 结肠黏膜上皮细胞微绒毛较多,较细长,杯状细胞较多,胞质内含有较多黏液滴. TEM×4 000
图8 UC模型+非穴组 结肠黏膜上皮细胞微绒毛稀少,短粗,可见少许杯状细胞,胞质内黏液滴减少,线粒体肿胀,内质网扩张. TEM×6 000

2.2
血清IL-6IL-8TNF-a含量及MPO 活性 与正常对照组相比,UC模型对照组上述指标均显著增高(P< 0.01).电针刺激足三里穴,可使已升高的MPO 活性显著下降(P <0.05 vs UC模型对照组),并明显降低血清TNF-aIL-6IL-8含量 (P <0.01,0.05,0.05 vs UC模型对照组).非经非穴刺激(足三里穴旁0.5cm)则对上述指标无显著影响(P >0.05 vs UC模型对照组)(2).TNF-αIL-6IL-8之间两两密切正相关(P <0.001). TNF-aIL-6IL-8又均与MPOMC/MB、组织损伤评分呈显著正相关(P≤0.001) (3).
1 电针足三里穴对结肠组织损伤评分的影响
分 组样 本 含 量RA - RBtP
nAnB
128819.0006.4438<0.01
138811.8754.0273<0.01
148817.1255.8079<0.01
23887.1252.4164<0.05
24881.8750.6359<0.05
34885.2501.7805<0.05

1为正常对照组, 2UC模型对照组, 3UC模型+针穴组, 4UC模型+非穴组
2 电针足三里穴对MC/MB、结肠组织MPO活性及血清TNF-aIL-6IL-8含量的影响(n =8,x±s)
分组MC/MB(mg/g)MPO(μkat/g)TNF-a(ng/L)IL-6(ng/L)IL-8(ng/L)
正常对照组2.46±0.4224.3±7.8894±24857±7153±42
UC模型对照组8.53±2.59b145.2±25.3b2278±170b170±36b806±125b
UC模型+针穴组5.29±2.04ace103.5±35.7bce1913±232bde125±34bce608±205bce
UC模型+非穴组8.04±3.07b142.4±45.0b2183±209b163±51b778±166b

aP <0.05, bP <0.01 vs 正常对照组; cP <0.05, dP <0.01 vs UC模型对照组; eP <0.05 vs 非穴组.
3 各指标间的相关性 (r
TNF-aIL-6IL-8MC/MBMPODamagescores
TNF-a-0.721a0.808a0.691a0.815a0.877a
IL-6--0.733a0.540b0.630a0.744a
IL-8---0.675a0.896a0.900a

aP <0.001, bP =0.001
3 讨论
溃疡性结肠炎(UC)是一种病因不明的慢性非特异性炎性肠病,以肠黏膜的慢性炎症和溃疡性改变为特征.免疫系统调节异常可能是其发病的中心环节,而细胞因子在免疫调节过程中起关键作用.促炎细胞因子TNF-a,IL-6IL-8可诱导和促进炎症发生;并可使肠成纤维细胞产生过量基质降解酶,破坏黏膜的完整性,形成溃疡[26]. TNF-a能诱导白细胞的黏附和脱颗粒,刺激单核细胞分泌炎症递质,促使肠组织产生过多的NO,参与UC发生过程中的炎症反应和组织损伤[27-31,38]IL-6作用广泛:可促进B细胞分化为浆细胞,增加免疫球蛋白的合成;促进T细胞增生,增强细胞毒性T细胞反应;促使粒细胞、巨噬细胞和单核细胞增生;诱导肝细胞生成急性期蛋白. IL-8是一种强有力的中性粒细胞趋化因子和活化因子,其主要作用是趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞的溶酶体酶活性,产生和释放大量的过氧化物,造成损伤,因而中性粒细胞是炎症反应可溶性递质的来源.MPO是中性粒细胞中的一种酶,其含量的增高可以反应中性粒细胞在某组织中的增高,评价组织中的炎症程度. TNF-aIL-6IL-8之间有一定的关联性, TNF-a可诱导IL-6IL-8产生.UC,上述促炎细胞因子协同作用, 趋化并激活炎细胞,使过氧化物和溶酶体酶释放增多,诱导型NO合成酶活性增高,合成大量NO,增强NK细胞的细胞毒性,参与UC的发病机制.
  炎症是UC的一个重要特征,表现为结肠充血、水肿、有炎性渗出物,结肠重量、组织损伤评分及MPO活性均显著增加,其病理学特征为杯状细胞减少,炎细胞浸润,隐窝脓肿等[5,20-25],本实验也观察到该炎症特征.许多人曾用ELISA、免疫-PCRRT-PCR等方法研究发现:活动性UC血清、结肠黏膜及直肠透析液中TNF-aIL-6IL-8水平均明显升高,其结肠黏膜中TNF-a,IL-6IL-8mRNA表达明显增加,且他们之间两两密切相关,这些细胞因子的表达和分泌均与疾病的炎症程度呈正相关[32-37].本实验用RIA法同样测得UC模型大鼠血清中TNF-a,IL-6IL-8浓度显著增加,TNF-aIL-6IL-8、结肠重量、组织损伤评分及MPO活性之间两两呈显著的正相关性.实验还发现与其他两个细胞因子相比, IL-8与组织损伤评分、MPO活性之间相关最密切.这就提示UC免疫功能紊乱,促炎细胞因子使UC具有慢性炎症特征,其含量增高参与UC的发生和发展过程,并反映疾病炎症程度.其中IL-8在炎症反应过程中起更直接的介导作用. TNF-aIL-6诱发的炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以IL-8为代表的趋化因子所介导的.
  中医理论认为,疾病状态下,经络会出现血气不和和阴阳偏盛的虚实征候,针刺穴位可激发经络本身协调阴阳的功能,泄其有余,补其不足,阴阳平复,达到调整虚实,防治疾病的作用.现代研究表明,神经内分泌系统与免疫系统之间有密切的双向调节联系.免疫细胞上有多种神经内分泌激素受体,多种激素会影响免疫功能,免疫细胞也可合成神经递质和激素影响内分泌系统,神经-内分泌-免疫系统紊乱参与UC发病.针刺可影响神经递质、内分泌激素和细胞因子的生成和表达,双向调节神经-内分泌-免疫网络,使异常机能向有利于机体的方向转化[8-10].足三里穴是足阳明经合穴,为土中之土穴,回阳九针穴之一,是强壮要穴和肚腹疾患之常用穴.现代腧穴学研究证实足三里可增强机体免疫功能,与气海、天枢等穴相配能调整胃肠功能、调整肠道内环境而达到治疗目的.张靖et al [11]实验发现,针刺足三里穴可提高正常大鼠胃肠组织中sIgA的含量,并增加其黏膜淋巴细胞的增生活力,从而增强胃肠道的黏膜免疫功能.电针足三里穴可抑制手术创伤应激引起高水平IL-1,并促进脾淋巴细胞生成IFN-γIL-2,改善损伤造成的免疫抑制效应.电针也可显著降低胶原性关节炎小鼠脾脏内源性IL-1浓度.有报道给大鼠腹腔注射LPS,发现大鼠皮质、小脑、垂体IL-1βIL-6mRNA表达显著增加,针刺后其表达减少.李艳梅et al [15]也发现电针足三里穴可下调因LPS诱发过高的血清TNF-aIL-6IL-1βNO水平.
  临床上用针刺治疗UC取得了良好的疗效,且副作用小[18,19],但相关的理论研究很少.实验发现电针UC模型大鼠的气海穴和天枢穴,可上调大鼠结肠黏膜和脾脏的抗炎细胞因子IL-1amRNA表达,降低促炎细胞因子IL-1βmRNAIL-6mRNAiNOSmRNA表达.电针还可减少 UC模型大鼠结肠黏膜固有层异常增多的IL-1βTNF-a阳性表达细胞.然而电针足三里穴对UC血清中TNF-aIL-6IL-8水平的影响的系统研究,尚未见报道.本实验结果表明,电针足三里穴可使UC中过高的TNF-aIL-6IL-8水平明显降低,并使结肠组织损伤程度有所减轻;且这些促炎细胞因子与结肠组织损伤程度评价指标(mC/mBMPO活性、组织损伤评分)之间呈显著正相关.由此可推测电针足三里穴能够有效地控制UC已启动的炎症和免疫级联反应.但从本实验结果中也可看出这些指标并未完全恢复至正常水平,可能与实验只观察足三里单穴位效果,未配合其他穴位治疗有关.
  总之,电针足三里穴可减少UC模型大鼠血清中TNF-aIL-6IL-8含量,降低结肠组织MPO活性,减轻结肠组织炎症和损伤程度,因而对UC有一定的治疗作用.该作用机制可能与电针足三里穴能够良性调节UC促炎细胞因子有关.但电针是否在下调促炎细胞因子水平的同时,相应上调有关的抗炎细胞因子(IL-4IL-10IL-13),来维持两者的平衡,以及调节这些细胞因子的机制尚不清楚,还需进一步探讨.
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